Polowanie na wirusa

…komórki rakowe to nie zwyrodniałe ludzkie komórki, jak do tej pory sądzono, ale żyjące w każdym z nas rzęsistki (Trichomonas) – jednokomórkowe organizmy, jedne z najstarszych na planecie. Jak pokazały badania naukowe rzęsistki mają zdumiewającą zdolność przekształcania się i dostosowywania do zmieniających się w organizmie warunków (dlatego tak trudno je rozpoznać). [altmedowy bestseller niejakiego Tombaka Michała o znamiennym tytule “Uleczyć nieuleczalne”]

Nie, uspokoję was, nie planuję w tym tekście wchodzić w dyskusję z żadnym autorem pseudonaukowych wypocin internetowych. Nie wierzę, by dało się kogoś tak oddalonego od rzeczywistości skłonić do przyjrzenia się osiągnięciom nauki, to raczej ta narracja w końcu, wedle której cała nauka to wielki światowy spisek. Zatem nie, nie będę udowadniać, że wirusy istnieją, pomyślałam jednak, że być może mogłoby was zaciekawić w jaki sposób ślady wirusów tropią patolodzy bazujący wszak przede wszystkim na mikroskopii świetlnej, dla której wirusy są w znakomitej większości zdecydowanie za małe. W codziennej pracy obserwujemy detale rozmiarów rzędu nawet dziesiątych części mikrometra, jednak poza odkrytymi w ostatnich latach olbrzymami (od zidentyfikowanego w 2003 roku mimiwirusa, przez megawirusa i pandorawirusy – potrafiące dochodzić nawet do 1,5 mikrometra – po najnowsze, tegoroczne odkrycie – Mollivirus sibericum), które osiągają wystarczającą dla mikroskopu świetlnego wielkość (ludzka czerwona krwinka ma około 7 mikrometrów średnicy na przykład), nie pozwala nam to na bezpośrednie śledzenie poszczególnych egzemplarzy wirusów. Ale mamy swoje sposoby.

Prawdopodobnie to czytelniczki prędzej niż czytelnicy mogły zetknąć się z frazą “cechy infekcji HPV” w wynikach badań cytologicznych bądź histopatologicznych. Wirus brodawczaka ludzkiego, czyli HPV właśnie, oraz ślady jego aktywności w komórkach nabłonkowych to klasyczny przykład wskazówek czy tropów pozostawianych patologom przez wirusy. Spójrzcie tylko na powyższe zdjęcie. To preparat cytologiczny, wykonany w ramach cytologii ginekologicznej (tak, tej właśnie, którą powinno się regularnie wykonywać w ramach profilaktyki raka szyjki macicy). Komórki na fotografii to nabłonek płaski złuszczony podczas badania z powierzchni tarczy części pochwowej szyjki macicy. Widzicie ostro odgraniczoną jaśniejszą obwódkę wokół jąder komórkowych komórek nabłonkowych z prawej strony ilustracji? Zauważyliście, że jądra komórkowe są większe i ciemniejsze niż w komórkach po lewej? Gdyby obejrzeć takich komórek więcej, można by zaobserwować także, że jądra często mają bardziej nierówny, “pognieciony” obrys, a niekiedy komórki potrafią być też na przykład dwujądrowe. Tak zmienione komórki nabłonka nazywamy koilocytami, a ich obecność koilocytozą,  przy czym nazwa ta powstała w roku 1956, a jej autor, Leopold Koss (pochodzący nota bene z Wrzeszcza, dzielnicy Gdańska), posługując się greką – koilos to po grecku pusty, wydrążony – nawiązywał właśnie do “pustej”, jaśniejszej przestrzeni wokół jąder koilocytów. Całokształt takich powstałych wskutek aktywności danego wirusa zmian morfologicznych w komórkach określamy zbiorczo mianem efektu cytopatycznego.

Efekty cytopatyczne poszczególnych wirusów bywają bardzo różne wizualnie, różne też mechanizmy kierują ich powstawaniem. Łączy je jedno – bywają nader przydatne diagnostycznie.

W przypadku HPV akurat nie znamy dokładnie wszystkich mechanizmów prowadzących do postania efektów wizualnych, choć wiemy, że kluczowymi elementami odpowiedzialnymi za powstanie okołojądrowego bąbla są wirusowe białka E5 i E6, przy czym do samego rozpoczęcia procesu “bąblizacji” komórki niezbędne wydaje się być także wirusowe biało E4, które wykrywane już na dość wczesnych etapach infekcji rozrywa wewnątrzkomórkowe sieci włókien cytokeratynowych, “rozluźniając” szkielet komórki. E5 (we współpracy z E6), sterując kompleksem zależnych od wapnia białek nazywanym kalpaktyną I, którego funkcją jest między innymi regulowanie połączeń pomiędzy obecnymi w komórkach błoniastymi strukturami, przyczynia się bezpośrednio do powstania okołojądrowych bąbli. Otóż, jak się wydaje, E5 wymusza skupienie się kalpaktyny I w pobliżu jądra komórkowego, a ta z kolei powoduje zlanie się obecnych w tej okolicy drobnych błoniastych pęcherzyków w wielką wakuolę – widoczny pod mikroskopem bąbel. Co więcej, nieregularny bąbel i zmienione poprzez aktywność wirusa jądro o nierównym obrysie (uciekając się do metafor bardziej kulinarnych, mówimy niekiedy o jądrach komórkowych pomarszczonych niczym rodzynki) widoczne są nie tylko w cytologii ginekologicznej, ale też w wycinkach z szyjki macicy (kolejny po cytologii etap diagnostyki podejmowany w razie niepokojących wyników tej pierwszej), stąd niekiedy można się zetknąć w wynikach histopatologicznych z frazą “Wycinki tarczy części pochwowej szyjki macicy pokryte nabłonkiem płaskim z cechami infekcji HPV”. Oczywiście, by obecność wirusa jednoznacznie potwierdzić i określić, z którym jego typem (nie wszystkie są wszak równie groźne i nie wszystkie wiążą się z podobnym ryzykiem nowotworzenia) mamy do czynienia, wykonuje się niekiedy dodatkowe badania molekularne, jednak – choć przydatne – nie są to informacje o charakterze dla patologów kluczowym.

Trzeba pamiętać, że HPV to nie tylko szyjka macicy. I nie mówię tu wyłącznie o czujności onkologicznej, bo choć – owszem – nowotwory złośliwe związane z HPV dotyczą zarówno okolic anogenitalnych u obu płci, jak i okolic nieco mniej z tym wirusem kojarzonych (jak jama ustna, gardło czy krtań chociażby), nie można zapominać, że poszczególne typy wirusa brodawczaka ludzkiego wiążą się z całym szeregiem zmian niezłośliwych również przecież przez patologów diagnozowanych, zatem koilocytów poszukujemy też w obrębie najróżniejszych typów brodawek skórnych i genitalnych (kłykciny kończyste, które bywają niekiedy prawdziwie imponujące, zatem zaleca się pewną dozę ostrożności przy przeglądaniu dokumentacji fotograficznej). By dołożyć wskazówek, w zmianach skórnych niektóre typy wirusa dodatkowo szczególnie intensywnie ingerują w procesy rogowacenia naskórka, pozostawiając wyraźne znaki swej bytności w postaci ziarnistych wtrętów, charakterystycznych zwłaszcza dla brodawek stóp (tzw. myrmecia), w których ziarnistości przypominające grudy keratohialiny wywołane (znów!) aktywnością wirusowego białka E4 uszkadzajacego włókna szkieletu komórki, są cechą nie do przeoczenia.

Chociaż zazwyczaj mówi się o wirusie brodawczaka ludzkiego, HPV, nie tylko  ludzi wirusy tego typu atakują, a obserwowane u psów efekty cytopatyczne czy to COPV (Canine Oral Papillomavirus, bądź po prostu CPV1) czy innych typów CPV (Canine Papillomavirus) bywają uderzająco podobne do tych obserwowanych u człowieka. Podobne problemy nie omijają kotów, tak dzikich, jak i domowych. Swoje papillomawirusy mają też różne inne ssaki, by wspomnieć chociażby o bobrze kanadyjskim, u którego kilka lat temu z brodawek skórnych udało się wyizolować nową bobrzą odmianę. Tak, obraz mikroskopowy bobrzej brodawki był podobny do wyżej prezentowanych :)

Z racji swej roli w powstawaniu nowotworów HPV jest w patologii wirusem budzącym najwięcej chyba emocji, zdecydowanie jednak nie jest jedynym, którego efekty obserwuje się pod mikroskopem. Większość czytających zapewne zetknęła się kiedyś z wywoływaną przez HSV1 (Herpes simplex), czyli HHV1 (human herpesvirus 1), opryszczką wargową czy opryszczkowym zapaleniem jamy ustnej, jeśli nie u siebie nawet, to u bliskich czy znajomych, niektórzy prawdopodobnie słyszeli też o opryszczce narządów płciowych (HSV2 znany też jako HHV2). Bardziej zainteresowani mogą kojarzyć opryszczkowe zapalenia rogówki bądź spojówek, a nawet opryszczkowe zapalenie mózgu, jeśli zaś kogoś bardziej pociąga wiedza weterynaryjna, będzie też świadom, że herpeswirusy w swej kociej odmianie (FHV-1) są (wraz z kocimi kalicywirusami, FCV) odpowiedzialne z rozwój tak zwanego kociego kataru, zespołu schorzeń tyleż nieprzyjemnych, co bardzo dla kotów niebezpiecznych, niekiedy kończących się utratą wzroku, a nawet zgonem.

Wirusy opryszczki są – obok HPV – wirusami o najbardziej chyba charakterystycznym obrazie mikroskopowym. Wielkie, wielojądrzaste komórki o szklistych, przejrzystych, nakładających się na siebie i zniekształcających swoją formę (modelujących wzajemnie swój kształt) jądrach komórkowych z nieregularnymi ciemniejszymi wtrętami natychmiast rzucają się w oczy.

Sama szklistość i powiększenie jąder komórkowych to efekt namnażania się i akumulacji cząsteczek wirusa spychających chromatynę jądrową na obwód. Rozmiar i mnogość jąder to przynajmniej po części rezultat zlewania się ze sobą zmienionych białkami wirusa błon komórkowych poszczególnych komórek. W literaturze anglojęzycznej lubiącej rozmaite sztuczki mnemotechniczne mówi się wręcz o związanych z zakażeniem wirusem opryszczki “trzech M” –

• Margination of chromatin in the nuclei (marginalizacja chromatyny jądrowej)
• Moulding of nuclei (nakładanie się na siebie i wzajemne modelowanie jąder)
• Multinucleation (wielojądrzastość)

Mniej jednoznaczną cechą są ciemniejsze wtręty w obrębie jąder komórkowych, zwane inkluzjami wewnątrzjądrowymi. Nazywamy je ciałkami Cowdry’ego. Ciałka Cowdry’ego A i B (różniące się nieco wybarwieniem) mogą występować także w efekcie działalności innych wirusów, chociażby wirusa ospy wietrznej-półpaśca (varicella–zoster virus, VZV) czy odry (zaznaczone zresztą na jednej z fotografii towarzyszących tekstowi o zaburzeniach neurologicznych odrze towarzyszących), stąd bywają wskazówką potencjalnie zwodniczą. Jak to w patologii bywa, pojedyncze cechy rzadko mają wartość diagnostyczną – trzeba je rozpatrywać niejako w komplecie. I w komplecie oceniane zmiany wywołane przez wirusy opryszczki są doskonale widoczne nie tylko w preparatach cytologicznych, ale też w wycinkach tkankowych.

Innym spośród rutynowo przez patologów opisywanych wirusów jest wywołujący cytomegalię CMV, cytomegalowirus, kuzyn wirusów opryszczki, zwany też HHV-5 (human herpesvirus-5). Cytomegalowirus jest szczególnie istotny dla osób z upośledzoną odpornością, jest też jedną z głównych przyczyn wrodzonych zakażeń noworodków, bywa przyczyną poronień. A poza tym, jak już się zapewne domyślacie, owszem, charakteryzuje się dość typowym, łatwym do wychwycenia efektem cytopatycznym. Nie bez przyczyny w przypadku komórek zainfekowanych CMV mówimy o obrazie “sowiego oka” bądź “sowich oczu”. Duża ciemnoniebieska wewnątrzjądrowa inkluzja otoczona przejaśnieniem wywołanym “rozpychaniem się” cząsteczek wirusa rzeczywiście może się z sowim okiem kojarzyć. Co więcej, taka histopatologiczna ocena “na oko” nadal, pomimo dostępności badań molekularnych, wydaje się być przydatna, długo jeszcze zresztą prawdopodobnie przydatna pozostanie – przeprowadzana niejako przy okazji i tak koniecznego badania samej niepokojącej klinicystów zmiany nie generuje dodatkowych kosztów, wciąż trudnych do zbagatelizowania przy badaniach molekularnych.

Polowanie na wirusy leżące u podstaw patomechanizmów procesów chorobowych wygląda zresztą podobnie także w innych przypadkach. W części infekcji kluczowe jest, by zmienionych komórek nie przeoczyć (a mówimy niekiedy o pojedynczych przecież komórkach), w innych, by skojarzyć oglądany obraz ze znanym nam (oby!) efektem cytopatycznym, bo też i czasem zmiany są masywne. Tak było w przypadku brodawek stóp wywołanych przez HPV, tak jest też zazwyczaj w przypadku mięczaka zakaźnego wywoływanego przez MCV (molluscum contagiosum virus), wirusy z rodziny Poxviridae (tej samej, do której należy też wirus ospy prawdziwej), zmiany zazwyczaj niewielkiej i niezbyt niepokojącej (choć zdarzają się wyjątki). Obraz histologiczny mięczaka jest bardzo charakterystyczny, z masą występujących w górnych warstwach naskórka “ciałek mięczakowatych” (molluscum bodies) zajmujących nie jądro komórkowe tym razem, a cytoplazmę komórki. Wtrętów wewnątrzjądrowych będziemy spodziewać się w zakażeniu parwowirusem B19, w preparatach szpiku kostnego.  Inkluzje cytoplazmatyczne nie zaskoczą nas podczas infekcji wirusem RSV (Respiratory Syncytial Virus), zwłaszcza gdy obecne będą wewnątrz olbrzymich, wielojądrzastych komórek gdzieś w obrębie dróg oddechowych. Można wymieniać najróżniejsze ciałka i komórki typowe dla poszczególnych wirusów, opowiadać o cytoplazmatycznych ciałkach Negriego typowych dla wścieklizny, o komórkach Warthina-Finkeldeya w odrze czy wspominać związane z ospą prawdziwą ciałka Guarnieriego. Litania podobnych nazw nie jest tu jednak najważniejsza – to w końcu szczegóły przydatne głównie specjalistom w codziennej pracy (ospa prawdziwa na szczęście już nie, a i ciałka Negriego szczęśliwie raczej nieczęsto), najistotniejsze jest, by pamiętać, że wirusy to nie tylko mikroskopia elektronowa i badania immunologiczne czy molekularne. Do skutecznego polowania na wirusy niekiedy wystarczy odpowiednio wyszkolone oko uzbrojone jedynie w zwykły, poczciwy mikroskop świetlny.

(Przypominam tylko, że patologów możecie śledzić też na fejsbuku)

Literatura:

Quick Reference Handbook for Surgical Pathologists. N Rekhtman, JA Bishop; Springer 2011

Textbook of Microbiology & Immunology. SC Parija; Elsevier 2014

Medical Microbiology. 4th edition. Chapter 44 – Effects on Cells. T Albrecht, M Fons, I Boldogh, AS Rabson; The University of Texas Medical Branch at Galveston 1996

Koilocytosis: a cooperative interaction between the human papillomavirus E5 and E6 oncoproteins. E Krawczyk, FA Suprynowicz, X Liu, Y Dai, DP Hartmann, J Hanover, R Schlegel; American journal of pathology 2008;173(3):682-8

The Human Papillomavirus Type 16 E5 Oncoprotein Translocates Calpactin I to the Perinuclear Region. E Krawczyk, FA Suprynowicz, JD Hebert, CM Kamonjoh, R Schlegel; Journal of Virology 2011;85(21):10968-975

The E4 protein; structure, function and patterns of expression. J Doorbar; Virology 2013;445(1-2):80-98

Diseases associated with human papillomavirus infection. HA Cubie; Virology 2013;445(1-2):21-34

Cytology and histopathology of cervical herpes simplex infection. ZM Naib, AJ Nahmias, WE Josey; Cancer;1966;19(7):1026-31

Molluscum Contagiosum in a 12-Year-Old Child – Report of a Case and Review of Literature. G Nandhini, K Rajkumar, KS Kanth, P Nataraj, P Ananthakrishnan, M Arunachalam; Journal of International Oral Health 2015;7(1):63-6